原文作者：Alban Mathieu

原文：《The future of skin metagenomics》

出自杂志：Research in Microbiology 165 (2014) 69-76

摘 要

宏基因组学（Metagenomics），是一种对环境微生物DNA的直接开发利用和对传统的细胞培养技术的补充，其目的是为了在众多的生态系统（包括与人体相关的生态系统，如口腔、唾液、牙齿、肠道或皮肤）中破译不同种类和功能性微生物的差异性。

通过PCR-扩增的rrs基因测定分析，从人体皮肤提取的DNA已经揭示了那些在人体皮肤繁殖的微生物群落（简称为“皮肤微生物群落”）的分类学多样性。每个个体都会有其独有的皮肤微生物群落结构，根据物理和化学条件（流汗、洗涤等）的影响，可以决定不同身体部位随着时间推移之间，微生物种类的明显差异。然而，科技的（限制）因素导致了人体皮肤表面的细菌密度变低或者受到了人类DNA的污染，限制了宏基因组方法在功能水平上研究皮肤微生物组的广泛使用。

在这些问题上进行改进，则有望能帮助我们理解这些微生物在适应每一种含特定化学成分的皮肤的适应机制，从而引导我们更好地理解细菌&人类宿主之间的相互依赖关系。而这些知识也将为药物和化妆品更系统化和个性化的应用作铺垫。

1、介绍

皮肤是人类最大的器官，平均面积可达1.8m²。在人类机体与外界环境的交界处，皮肤持续暴露在化学和生物的侵袭中，并且还对机体提供了有效的保护作用。

皮肤的外观是体现内部健康的一个很好的标志，在面对任何挑战时，它都会迅速地作出反应。从以往的观点来看，皮肤微生物组学仅限于研究从皮肤病理学中分离出来的微生物，包括那些引起病症的微生物和那些由病症所产生的微生物。

然而，皮肤微生物组学的存在范围远远超过了这些病理学层面，因为在皮肤的任何一个地方都能检测出非病理性的细菌，甚至在一些区域里，就有多达107个每平方厘米的细菌。皮肤不是无菌的人体器官，而是共生微生物的生态区，这些共生微生物的存在可以阻止病原体的定殖，参与对抗病原体的保护工作。

早在很久之前，皮肤微生物组学就被考虑用来研究皮肤的共生细菌了，但是由于大多数细菌不能在体外进行培养，或者由于它们的某些作用被忽视了，直到这些基于直接从皮肤中提取的DNA扩增和测序的新方法出现，才得以被应用。在许多含有大量细菌的环境下，很难对单个细菌进行分离，宏基因组学的出现就彻底改变了这种微生物学的研究。

这种方法的第一个优势就是，能更精准的估计微生物的多样性，这是传统方法难以做到的点。然而，有趣的是，通过提供关于细菌活性、功能和与其他生物体之间的关系的信息，可以发现宏基因组学所涉及到的细菌种类超过了原有的细菌名单的范围。

举个例子，人类肠道微生物组的测序结果显示，许多肠道细菌参与了炎症性疾病的发作，如，柔嫩梭菌群（Faecalibacterium prausnitzii ）对克罗恩病（Crohn’s disease）起着重要作用。同样的方法也表明了，如最初被严格认为是由环境和宿主的遗传性参数（基因）引起的肥胖，现在证实与在肠道内繁殖的细菌的特定功能有着密切联系。

在这篇文章中，我们的目的是为了回顾将宏基因组学方法应用于人类皮肤的首次尝试。我们考虑了与皮肤异质性相关的特定困难因素，这取决于机体的部位和这些部位上相对较低的细菌密度。另外，我们还证实了，当所有方法学上的困难被克服后，这种方法在健康和工业上，如制药和化妆品行业中的应用，可能会有什么样的预期效果。

2、培养方式

使用细菌培养技术的方法，就有大约30种细菌类型被确定，它们被视为是皮肤共生体或病原体。据估计，这30种占了皮肤微生物总数的10% 到50% 。而还没被发现的品种则归属于未发展的微生物组，它们的相关占比系数（50% - 90%）比在其他的环境（比如在土壤，它们就可以达到将近99.9 % ）中呈现得更低。细菌培养技术的优势在于单细胞无性繁殖产生的菌落可以为开展生理学和遗传学研究提供了足够的原材料，包括完整的基因序列（见图1）。

这些方法所确定了的特定代谢特征和功能，决定了这些生物体的生活方式（碳源利用率、氧源依赖、对化合物的抗性等）。这些新陈代谢的特征和功效性的能力则可以帮助在研究这些细菌与人类宿主之间的寄生关系上建立连贯假设。

然而，接下来的问题是，某些特定细菌的存在是否是导致皮肤病变的原因或后果。即时抗菌剂治疗法可以减轻一些皮肤病变的症状，并支持病理微生物的假设暗示，这种相关性并不能对任何给定的病理中的细菌的来源提供一个确定的结论。

对于痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes ）来说情况就是这样的，我们发现，它与寻常性痤疮的发病机制之间的关系，并没有明确的证据可以表明它对其病理状态有因果贡献。

同样地，其他皮肤细菌甚至扮演着具有潜在保护作用的角色，如表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）；而如A族链球菌（ Group A Streptococci），它可以产生可溶于苯酚的调控蛋白，能增强宿主抗菌肽对病原菌的杀灭活性，当然这也依然是假设。

主要的问题是，如果没有考虑到整个微生物群落，而仅仅基于对某些种群的研究，就不能全面地理解皮肤细菌的全面（积极或消极）影响。只有在密切的相互作用下进行活动的不同细菌种群之间的关系，以及它们与宿主之间的关系，才能解释特定的皮肤病理或细菌对病原体的防护效应。虽然细菌在皮肤上存在和活动会影响它的外观，虽然人们强烈质疑它们对人类健康的影响，但要更好地了解这些复杂的关系，需要使用分离培养之外的方法来进行研究。

3、宏基因组学的定义

宏基因组学的方法不具有与基于细菌培养技术的方法相同的局限性。直接从环境（即皮肤）得到的细菌DNA的复原和利用与微生物菌群的可栽培性状态无关。最初，宏基因组学是指构建具有环境DNA的重组克隆文库，直到一个更广泛的定义被接受，用于考虑使用群落-提取DNA方法的所有分析应用，包括PCR、DNA芯片、克隆、测序等，就是广义上的（sensu lato）宏基因组学。

4、走进皮肤微生物组

人类皮肤是一个易于接近的生态系统，但相比于其他生态系统，具有特殊的局限性，就是具有较低的微生物种落密度。而这种低密度的表现就妨碍了某些分析工具的应用，如直接的高通量测序。

最初认为，皮肤结构是为了让细菌DNA的高度复原率和人类DNA的低度污染率之间得到一个强行调解。但是，最初的结果表明，皮肤常规擦拭生产出的DNA溶液中，只有不到3%的人类DNA是受了污染的，这大概是细胞去核后产生了鳞状结构，从而引起DNA降解的结果。然而，皮肤细菌群落的分类结构，使用活组织检查和划伤等方法更深入皮肤表层提取的，从统计学意义上来看，和那些基于擦拭方法的结果没有什么不同（见图2）。

有一种解释说，是角质形成细胞将微生物从基底膜转移到皮肤表层。擦拭法似乎是制造相对无污染的DNA溶液的较好方法之一，这种溶液代表着细菌与人类细胞的密切互动。但仍然，还没有完成的DNA复原和某些细菌对溶菌处理的抗性一样，因此我们可能低估了细菌的实际多样性。

5、皮肤微生物的分类特征

皮肤特异性的倾向导致人类偏爱于用PCR法来分析皮肤微生物，其中有个重点就是rrs基因（也称16S rRNA 基因）。这个普遍存在的基因中的不同区域，是目前几乎所有细菌进行常规的PCR扩增时，都会用到的“通用”引物，设计的目标是侧翼的保守区域，因此在PCR产物测序之后，容许有复杂的微生物群落分类特征。

PCR测序法的敏感性和特异性非常适合用来研究那些可能被人类DNA污染了的皮肤微生物的特征，仅需要一个低含量的DNA模板。PCR产物增加了繁殖在人类皮肤上的细菌种类目录。然而，自然环境中所有关于微生物多样性的研究，采用基于PCR方法的宏基因组学方法也可能无法扩增所有的rrs基因。所谓的“通用”引物，就是数据库中可用序列的子集对齐，这远远不能涵盖所有微生物，包括那些具有足够相异性，以防止扩增的的rrs序列。

基于rrs基因的方法帮助增加了已知的人类皮肤微生物分类多样性的比例，同时也暗示了个体和身体部位之间的差异性。大约有200个种已经被识别。我们发现皮肤的每一个部位都表现出它自己的特异性，根据共同的物理特征将不同的身体部位进行分类：干燥的、分泌脂质的和湿润的。每一种特定环境都由特定的细菌群落所构成（见图3）。

分泌脂质的环境，是以丙酸菌属为主的微生物群落为特征，其分类学多样性较低。个体间的群落结构差异不大，说明在这种分泌脂质的皮肤微环境中，核心微生物群系是相当占强势的。

湿润的环境，通常被棒状杆菌属（Corynebacterium ）和葡萄球菌属（Staphylococcus ）所支配。它们还显示出比分泌脂质的环境具有更高的细菌多样性。干燥的部位具有更低的多样性。干燥的部位或多或少是由β-变形菌（Beta-proteobacteria ）所支配的。虽然它们被各种各样的门属类群的混合代表所殖民，但相对于其他皮肤部位观察到非常低的变形菌丰度，在干燥的部位出现的高比例变性菌（如革兰氏阴性菌），可以被认为是非常特殊的。除了数量上或多或少的细菌外，其他微生物也能在皮肤上繁殖，包括真核生物，如马拉色菌（Malassezia ），它是一种偶尔与银屑病症相关的共生真菌；或食皮螨（Dermatophagoides ），它是一种室内尘螨，它的蛋白质与各种过敏反应有牵连关系。

此外，病毒微生物（病毒组）也是一种重要的皮肤成分，根据最近对健康皮肤进行的宏基因组学研究来看，尽管使用了多种置换扩增（multiple displacement amplification，MDA ），但该研究仍然显示了相当多的病毒多样性，包括多瘤病毒、乳头瘤病毒和圆环病毒。

未完待续......

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